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文七爺
編輯七街酒舍
前言
生長素被認為是一種次級休眠植物激素，控制種子休眠和萌發。
然而，外源生長素控制的種子休眠和萌發在生理過程和基因網絡中仍不清楚。
研究中，發現外源生長素介導的種子二次休眠是一種環境模型，可防止種子在不利條件下萌發。
其種子不能正常吸水，其胚根也不能正常發育出苗。
為了完成發芽，種子會刺激更多的GA合成來對抗外源生長素的刺激。
外源生長素調節多代謝網絡控制種子次級休眠和萌發，其中最重要的是我們發現生長素響應性種子次級休眠是指表觀遺傳調控和萌發以增強Met通路。
一、種子休眠取決於外源生長素水平
考慮到生長素對擬南芥種子休眠的控制，推測外源高濃度的生長素可能會促進菸草種子的二次休眠。
研究發現，與浸泡在0、10和100 mg/l IAA溶液甚至未浸泡的種子相比，浸泡在1000mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)溶液中的菸草種子發芽明顯減少。
二、外源生長素調節種子發芽胚根的出現
分析了外源生長素對種子萌發的影響，包括吸水、胚根出現、胚乳破裂和子葉展開測定。
結果表明，與在ddH 2O中相比，在1000 mg/l IAA溶液中吸收的種子液泡無法正常展開。
此外，包括胚根重量、長度和表面積在內的胚根性狀明顯較弱，但β-1葡聚糖酶活性沒有顯著差異。
即使大約一半的子葉在發芽過程中展開，所有種子的胚根也沒有出現。
三、赤黴素水平受外源生長素而非脫落酸調節
檢測了外源性IAA對內源性激素《包括 ABA、GA 和 IAA》含量的影響。
三個萌發階段ABA、GA 1+3和IAA的動態變化。
結果表明，在所有三個萌發階段， 浸泡在梯度濃度生長素溶液中的種子與浸泡在ddH 2 O中的種子之間的ABA含量沒有顯著差異。
然而，GA 1+3和IAA含量明顯更高，尤其是在第一階段。
四、外源生長素控制種子休眠和萌發的轉錄組分析
0、72或156小時後發芽的0或1000mg/l IAA吸水種子的三個重復分別被收集、混合然後用於 總RNA分離。
之後，如『方法』中所述制備並測序雙端文庫，分別使用Fast QC軟件和Phred measure Score檢查數據和生成序列的質量。
在所有情況下，高質量片段的百分比都>80%《Phred 值的 20個或更多單位，對應於1%的測序錯誤率》。
所有RNA-seq 樣本平均生成約 3700 萬個高質量配對末端讀數《2×100 bp》。
研究得到了大約2.63億個讀數對，超過526億個堿基。
對於每個RNA-seq樣本，72.61–91.43%的讀取被映射到N.tabacum K326參考基因組的基因組使用TopHat 軟件；
在此之後，研究使用Cufflinks程序將映射的讀取重新組裝到每個樣本的一組轉錄本中。
然後使用cufflinks中的cuffmerge模塊合並每個樣本的轉錄本，生成一個獨特的轉錄本集，也被命名為unigenes。
去除長度<200bp的轉錄本後，共檢測到107403個unigenes。
這些unigenes的平均長度為1757 bp，N50值為2105 bp，長度范圍為200 bp至14,848 bp。
有80494 (74.94%) 個長度≥1000 bp的單基因。
對於unigenes的功能註釋，研究使用了針對NCBI NR數據庫的blastx搜索，以1E-05的E值作為截止值。
blastx搜索結果顯示，使用了大約91840 (85.18 %)個在NR數據庫中具有顯著命中的unigenes。
大多數unigenes與NR數據庫序列具有很高的相似性。
它們包括E值≤ 1.0E-100 的 70439 (65.58 %) unigenes 和E值≤ 1.0E-5 的 91839 (85.51 %) ungenes。
91839個unigenes中blastx命中率最高的顯示前兩個命中率最高的物種是Solanum lycopericum(38302，41.71 %)和Solanum tuberosum(37890，41.26 %)，是茄科最重要的模式生物。
對於unigenes功能分類，對EuKaryotic Orthologous Groups (KOG) 數據庫進行了 blastx 搜索，結果顯示60497個unigenes與25個KOG簇匹配。
KOG分類顯示最大的類別是’general function prediction only’，這與其他研究相同；以下類別是『翻譯後修飾、蛋白質轉換、分子伴侶』。
對於基因本體 (GO) 註釋，Blast2GO套件用於根據NCBI NR數據庫的blastx搜索結果檢索GO 術語。
在91839個帶註釋的unigenes中，有76969個unigenes至少註釋了一個GO term。
結果，62074個unigenes 被分為生物過程 (BP)，61316 個被分為分子功能(MF)組，56760 個被分為細胞成分 (CC) 組。
最後，KAAS工具用於識別unigenes的通路。
有 23261 個 (21.66%) unigenes被分配到2100個京都基因和基因組百科全書 (KEGG) orthologs，它們被分類到327個KEGG通路中。
為了量化每個RNA-seq樣本中的unigenes表達，研究使用bowtie將幹凈的RNA-seq讀數映射到所有unigenes序列，然後使用eXpress軟件計算每千堿基外顯子映射的片段數《FPKM》，用於unigenes每個樣品。
五、生長素響應休眠種子和初級休眠種子的基因表達譜不同
通過分別比較未處理的種子《初級休眠》和生長素吸收的種子《次級休眠》與H2O吸收的種子《無休眠》來進行差異表達分析。
在p<0.05 和倍數變化≥2的顯著水平下，在未處理的種子和H2O吸收的種子 之間鑒定了1958個上調和2917個下調的unigenes。
在相同條件下，還在生長素吸收種子和H2O吸收種子之間鑒定了2506個上調和2634個下調 unigenes。
確定未處理種子和生長素吸收種子之間相對於H2具有差異表達模式的unigenes以吸氧種子、吸氫種子為對照，計算9種表達模式的單基因數。
Percentage FC和Unigene FC柱是根據unigene的表達倍數變化計算的，其中unigene的fold change<0.5視為下調，fold change>2.0視為上調; 其餘的視為不變。
III/VII模式相對於吸氫種子具有完全差異化的調節趨勢。
在IV/VI模式中，unigenes在生長素吸收的種子和H2O吸收的種子之間表現出差異表達，但在未處理的種子和H 2吸收的種子之間保持不變O-吸收的種子。
因此，這四種表達模式中的unigenes也可以被認為是導致初級休眠和生長素誘導的次級休眠機制差異的主要因素，並可用於功能分析。
六、生長素響應發芽種子和常規發芽種子的基因表達譜不同
使用與休眠實驗相同的方法，進行了常規發芽種子(H2O-72)和生長素響應發芽種子(IAA-156) 相對於生長素響應休眠種子(IAA-72)的差異分析。
首先，在P<0.05和倍數變化 ≥ 2的顯著水平下，我們在未處理種子和H2O吸收種子之間鑒定了3526個上調和2073個下調單基因。
在相同條件下，我們還在生長素吸收種子和H2O吸收種子之間鑒定了4458個上調和1616 個下調unigenes 。
對常規發芽種子《H2O-72》和生長素反應性發芽種子《IAA-156》兩種發芽狀態種子與生長素反應性休眠種子《IAA-72》進行了轉錄組比較分析。
unigenes進一步分為9種表達模式。
與上述休眠種子的差異表達分析一樣，僅分析III/IV/VI/VII模式的unigenes，以鑒定樣品IAA-156和樣品H2O-72之間具有差異表達的基因。
這些基因也可以被視為導致生長素響應發芽種子與常規發芽種子之間機制差異的主要致病因素。
結論
與微尺度外源ABA控制種子休眠不同，這種外源生長素介導的種子休眠更可能是一種環境模型，可防止種子在不利條件下發芽。
與子葉相比，胚根對外源生長素的刺激更為敏感。
種子在1g/L外源生長素溶液中不能正常發育和出苗。
響應於外源生長素的刺激，種子會刺激更多的赤黴素合成以對抗生長素的作用。
隨著生長素水平的降低，種子從休眠狀態恢復到發芽狀態。
主成分分析表明，與初級休眠種子相比，生長素響應休眠種子的轉錄組與吸水種子的轉錄組更相似。
與生長素響應休眠種子相比，生長素響應發芽種子的轉錄組與常規發芽種子的轉錄組更相似。
為了獲得生長素誘導的信號通路，未處理種子和生長素吸收種子相對於H的unigenes顯示差異表達選擇2個吸氧種子，用於基因功能分析。
生長素響應休眠與黃酮醇生物合成過程、赤黴素代謝過程、腺苷酸硫酸還原酶活性、硫氧還蛋白活性、谷氨酸合酶(NADH)活性和染色質調節有關。
生長素響應性萌發響應ABA、生長素、JA和SA介導的信號通路《紅光、遠紅光和藍光》、谷胱甘肽和蛋氨酸代謝，其中最重要的是我們發現生長素響應性二級種子休眠是指表觀遺傳調控和發芽以增強 Met 途徑。
因此，我們的研究揭示了一個以前未被認識的轉錄調控網絡和種子休眠和萌發的生理發育過程，以及多餘的生長素信號激活。
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